ВЫДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ РНК ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ

Осадок лейкоцитов после выделения и очистки суспендировали в 10 объемах (1 мл) раствора 1, содержащего 4 М гуанидин тиоцианат, 25 мМ цитрат натрия, рН 7,0, 0,5% саркозил и 0,1 М 2-меркаптоэтанол, при комнатной температуре. Затем добавляли 0,1 мл 2 М раствора NaAc, рН 4,0, 1 мл фенола, 0,2 мл хлороформа и перемешивали. Затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин при 4оС, отбирали водную фазу, добавляли к ней равный объем изопропанола и осаждали РНК центрифугированием при 15000 g в течение 15 мин при 4оС (Chomczynski and Sacchi, 1987).

ВЫДЕЛЕНИЕ ВЫСОКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ДНК ИЗ ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

1 г печени стерляди, замороженной в жидком азоте, растирали в тонкий порошок и гомогенизировали в 15 мл раствора, содержащего 0,5 М Na2ЭДТА, рН 8,0, 0,5% саркозила, 100 мкг/мл протеиназы К и нагретого до 65оС. Затем инкубировали при 50оС течение 3 часов при легком покачивании. Затем, избегая резких встряхиваний, экстрагировали ДНК равным объемом фенола три раза, каждый раз разделяя фракции центрифугированием при 4000 g и комнатной температуре. Фенол предварительно очищали перегонкой и насыщали буфером, содержащим 1 М трис-HCl, один раз и два раза буфером, содержащим 0,1 М трис-HCl и 0,1% 2-меркаптоэтанол. Диализ ДНК проводили при 10оС в течение 12 часов против 4 л буфера, имеющего состав:

50 мМ трис-HCl, рН 8,0,

10 мМ Na2ЭДТА,

10 мМ NaCl.

Затем обрабатывали пробу РНКазой, свободной от ДНКазы,при 37оС в течение 1 часа в концентрации 100 мкг/мл. После этого экстрагировали ДНК равным объемом смеси фенол-хлороформ (1:1) два раза и проводили диализ при 10оС в течение 36 часов против 10 л буфера TE (10 мМ трис-HCl, 1 мМ Na2ЭДТА, рН 7,5), меняя буфер через каждые 12 часов (Маниатис и др., 1984).