Следует отметить, что сомовые и лососевые являются довольно специализированной группой, возникшей в эволюции относительно недавно. Особенности организации генов легких цепей у этих таксонов могут представлять собой новоприобретенные признаки (Romer, 1966).

В связи с этим особый интерес представляет изучение структры и организации генов L-цепей ИГ у костно-хрящевых рыб. Костно-хрящевые являются архаичной группой костистых рыб, возникшей значительно раньше настоящих костистых. Несмотря на то, что существуют различные мнения относительно последовательности появления костно-хрящевых и двоякодышащих (предков наземных позвоночных) (Ромер и Парсонс, 1992; Юдкин И. И., 1941), очевидно, что костно-хрящевые в большей степени чем коститстые сохранили черты древних первично-костных рыб и, соответственно, с большим основанием могут рассматриваться как промежуточное звено между хрящевыми рыбами и амфибиями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ДНК

В агарозном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 1% агарозном геле в 1-кратном буфере ТАЕ, имеющем состав: 0.04 М трис-ацетат, 2 мМ Na2ЭДТА (Маниатис и др., 1984).

В полиакриламидном геле.

Электрофорез ДНК проводили в 6% полиакриламидном геле в 0,5-кратном буфере ТБЕ, имеющем состав: 0,089 М трис-борат, 0,089 М борная кислота, 2 мМ Na2ЭДТА. Для полимеризации геля к 50 мл раствора добавляли 300 мкл 10% раствора персульфата аммония и 30 мкл ТЕМЕД (Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК ИЗ ГЕЛЯ

Адсорбция на диэтиламиноэтилцеллюлозе.

Гель окрашивали в растворе бромистого этидия, участок геля с полосой ДНК вырезали, помещали в камеру и переносили ДНК на диэтиламиноэтилцеллюлозу в 0,5-кратном буфере ТБЕ (см. Электрофорез ДНК (2)) при напряжении 40 В/см. Элюцию ДНК с диэтиламиноэтилцеллюлозы проводили путем инкубирования в течение 30 мин при 70оС в буфере, имеющем состав: 2 мМ NaCl, 1 мМ Na2ЭДТА, 40 мМ трис рН 8,0 (Маниатис и др., 1984).

Адсорбция на кремниевой пудре.

Агарозный гель окрашивали в растворе бромистого зтидия, вырезали участок геля с ДНК и расплавляли инкубированием с двойным объемом 6 М раствора KI в течение 10 мин при 55оС. Затем добавляли суспензию кремниевой пудры (силики) в 3 М растворе KI в концентрации 100 мг/мл из расчета 300 мкг силики на 1 мкг ДНК и инкубировали в течение 2 мин при 55оС. После этого осаждали силику центрифугированием при 2000 g в течение 2 мин и дважды промывали суспендированием в растворе, содержащем 50 мМ NaCl, 10 мМ трис-HCl, рН 8,0, 2,5 мМ Na2ЭДТА и 50% этиловый спирт. Элюировали ДНК с силики суспендированием в воде (Boyle, Lew, 1995).

Замораживание - оттаивание.

Агарозный гель с ДНК 10 мин инкубировали в жидком азоте и осаждали центрифугированием при 12000 g в течение 15 мин, после чего добавляли к супернатанту 1/10 объема 3 М NaAc, 2 объема этанола и осаждали ДНК при 12000 g в течение 10 мин.

ПОЛУЧЕНИЕ РАДИОАКТИВНЫХ ЗОНДОВ

500 нг ДНК-матрицы и 100 нг праймера денатурировали в 10 мкл воды при 100оС в течение 10 мин и быстро охлаждали до 0оС. Затем добавляли 10 мкл 10-кратного буфера (40 мМ KP04 рН 7,5, 6,6 мМ MgCl2 и 1,0 мМ 2-меркаптоэтанол), 0,1-0,5 мКи 32Р-dATФ, 10 мкл 2 мМ раствора трех других немеченых дНTФ до концентрации 200 мкМ. Объем реакционной смеси доводили водой до 100 мкл, добавляли 3 мкл фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I (10-12 е.а.) и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Очистку зонда проводили методом гель - фильтрации на колонке с биогелем П-10 (Маниатис и др., 1984).

ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК

Клетки Escherichia coli, выращенные в среде Луриа-Бертани (1% NaCl, 1% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, рН 7,5) (среда LB) с ампициллином (50 мкг/мл), осаждали центрифугированием при 4000 g. Затем осадок суспендировали в буфере STET (8% сахароза, 0,5% тритон X-100, 10 мМ трис-HCl и 50 мМ Na2ЭДТА, рН 8,0) и добавляли лизоцим до концентрации 0,8 г/мл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин и при 100оС в течение 1 мин. После этого клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 16000 g в течение 15 мин.