Для осаждения плазмидной ДНК к супернатанту добавляли 1/10 объема 3 М раствора ацетата натрия, равный объем изопропанола и центрифугировали при 16000 g в течение 15 мин при 20оС. Затем промывали осадок добавлением 80% этанола и повторным центрифугированием в течение 5 мин при 20оС (Маниатис и др., 1984).

ОЧИСТКА ПЛАЗМИДНОЙ ДНК МЕТОДОМ РАВНОВЕСНОГО ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЯ В ГРАДИЕНТЕ ПЛОТНОСТИ CsCl

На каждые 10 мл раствора плазмидной ДНК, полученного после осаждения лизированных клеток (см. Выделение плазмидной ДНК), добавляли 1 г сухого CsCl, соль растворяли, после чего на каждые 10 мл раствора добавляли 0,8 мл раствора бромистого этидия с концентрацией 10 мг/мл. Смесь помещали в центрифужные пробирки Beckman, заполняли доверху раствором CsCl и бромистого этидия той же плотности и центрифугировали в роторе Ti 60 при 45000 об/мин и температуре 20оС в течение 36 часов. После этого отбирали кольцевую ковалентно замкнутую плазмидную ДНК и экстрагировали бромистый этидий из раствора до полного обесцвечивания равным объемом н-бутанола, предварительно насыщенного 1 М раствором NaCl.

ДНК осаждали центрифугированием при 15000 g, добавив равный объем 1 М раствора NH4Cl и два объема этанола. После промывания этанолом осадок ДНК растворяли в воде до концентрации 1 мкг/мкл (Маниатис и др., 1984).

ТРАНСФОРМАЦИЯ ПРОКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТОК

Химическая трансформация.

Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' и выращивали в 100 мл 2-кратной среды Луриа (2% бакто-триптон, 1% бакто-дрожжевой экстракт, 0,1% NaCl, 0,4% глюкоза, рН 7,0) при 37оС до оптической плотности D550=0,35. Клеточную суспензию выдерживали при 0оС в течение 2 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, температуре 4оС и суспендировали в 50 мл ледяного буфера А (100 мМ CaCl2, 70 мМ MnCl2, 40 мМ NaAc, рН 5,5). После этого суспензию клеток выдерживали при 0оС в течение 30 мин, после чего клетки осаждали и суспендировали в 5 мл буфера А с 15% глицерина.

Для трансформации к 200 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 30 нг плазмидной ДНК, растворенной в 100 мкл воды и выдерживали при 0оС в течение 30 мин. Затем инкубировали при 37оС в течение 5 мин, после чего добавляли 3 мл среды LB и инкубировали при 37оС еще 90 мин. Клетки собирали центрифугированием и высевали на селективную среду (Мазин и др., 1988).

Электротрансформация.

Для подготовки компетентных клеток E.coli штамм XL-1 Blue MRF ' выращивали в 100 мл среды LB (см. Химическая трансформация) при комнатной температуре до оптической плотности D550=0,45. Затем клетки осаждали центрифугированием при 4000 g, 4оС и промывали суспендированием последовательно в 100 мл, 50 мл и 10мл 10% раствора глицерина при 0-4оС. После этого клетки суспендировали в 240 мкл ледяного раствора GYT (10% глицерин, 0,125% бакто-дрожжевой экстракт, 0,25% бакто-триптон).

Для трансформации к 40 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 1 мкл ДНК вектора (50 нг) при 0-4оС и пропускали электрический разряд (U=18000 В). Затем добавляли 1 мл SOC (2% бакто-триптон, 0,5% бакто-дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4, 20 мМ глюкоза), перемешивали, переносили в 3 мл среды SOC, прогретой до 42оС, и инкубировали при 37оС в течение 1 часа (Wai Lin Tung and King-C. Chow, 1995).

ВЫДЕЛЕНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ИЗ КРОВИ РЫБ

Кровь собирали на холоду через каудальную артерию с добавлением на каждые 5 мл крови 1 мл 2,7% раствора Na2ЭДТА, рН 7,4. К выделенной крови добавляли равный объем трис-солевого буфера (TBS) (0,14 М NaCl, 5 мМ KCl, 25 мМ трис-HCl, рН 7,4). Смесь наносили при комнатной температуре на равный объем среды для выделения лейкоцитов, содержащей 24 части 9% фикола и 10 частей 34% верографина. После центрифугирования при 400 g в течение 30 мин отбирали слой лейкоцитов и разводили в большом объеме буфера TBS. После повторного центрифугирования при 300 g в течение 40 мин для лизиса остаточных эритроцитов клетки суспендировали в растворе, содержащем 9 объемов 0,83% раствора NH4Cl и 1 объем 2,06% раствора трис-HCl, рН 7,62, до концентрации 108 кл/мл и добавляли 5 объемов среды. После осаждения клеток при 300 g в течение 10 мин процедуру очистки повторили (Фримель, 1987).